ماتيو - موريل - وايزمان - الفوركس

عدم التجانس الخلوي يتوسط حساسية الحساسية المتأصلة المقايضة في استهداف السرطان من قبل الدوائر الاصطناعية ماثيو موريل أ. ب. ج. 1. رومان شترمان أ. 1. فاردا روتر د. ليور نسيم ه. 2. وروي H. بار-زيف أ. 2 قسم المواد والواجهات، معهد وايزمان للعلوم. ريهوفوت، إسرائيل، 76100 ب إكول نورمال سوبيرييور، باريس سسينسس إت ليترس (بسل) جامعة الأبحاث، جامعة بيير إت ماري كوري، نرس. ديبارتيمنت دي تشيمي، أومر 8640 باستور، 75005 باريس، فرنس c ونيفرزيت بيير إت ماري كوري باريس 06، كول نورمال سوبيرييور، نرس. أومر 8640 باستور، 75005 باريس، فرنسا d قسم البيولوجيا الخلوية الجزيئية، معهد وايزمان للعلوم. ريهوفوت، إسرائيل، 76100 ه مركز البيولوجيا التخليقية، معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا. كامبريدج، ما 02139 تحريرها من قبل جوس N. أونوشيك، جامعة رايس، هيوستن، تكس، واعتمدت 3 يونيو 2016 (وردت للمراجعة 16 مارس 2016) أهمية التقدم الأخير في استخدام ناقلات الفيروسية لتسليم الجينات، جنبا إلى جنب مع تصميم الدوائر الجينية الاصطناعية لتشخيص واستهداف الخلايا، ويجلب فرصا لعلاج فعال للسرطان. حتى الآن، تم اعتبار الدوائر الجينية أجهزة منطقية قادرة على التمييز الطبيعي من الخلايا الخبيثة كدول منفصلة، ​​وتجاهل التجانس الخلوي في علامات التعبير السرطان. تناولنا أوجه القصور الكامنة يفرض عدم التجانس على دقة دوائر الاستهداف. باستخدام المعلمات الجزيئية للسيطرة على تضخيم مكاسب الدوائر وعتبة، وتبين لنا تراجعت المتأصلة بين الخصوصية والحساسية. في ضوء هذه المقايضة، فإن التحسين الجزيئي للدوائر الاستهداف سيكون خطوة هامة للتنفيذ الفعال للعلاج الجيني شخصية. والدوائر الجينية الاصطناعية آخذة في الظهور كوسيلة تنوعا لاستهداف السرطان مع تعزيز خصوصية التكامل التكاملية من علامات التعبير متعددة. يجب أيضا ضبط هذه الدوائر لتكون حساسة للغاية لأن الهروب من عدد قليل من الخلايا قد يكون ضارا. ومع ذلك، فإن معدلات الخطأ في دوائر صنع القرار في ضوء التباين الخلوي في التعبير الجيني ظلت حتى الآن غير مستكشفة. هنا، نقيس وظيفة استجابة خلية واحدة للمنطق الانضباطي وبوابة تعمل على اثنين من المروجين في السكان خلية غير متجانسة. تحليلنا يكشف عن التبادل المتأصل بين خصوصية والحساسية التي يتم التحكم بها من قبل كسب التضخيم بوابة أند وعتبة التنشيط. ونحن ننفذ الورم محاكاة نموذج خلية الثقافة من الخلايا السرطانية الناشئة في خلفية من تلك العادية، وتبين أن المعلمات الجزيئية للدوائر الاصطناعية السيطرة على خصوصية وحساسية في مقايسة القتل. وهذا يوحي بأن الدارات التركيبية التي تعمل في بيئة غير متجانسة يمكن أن تكون، إلى ما هو أبعد من المقايضة المتأصلة، من أجل استهداف الدولة الخبيثة بكفاءة مع الحد الأدنى من فقدان الخصوصية. 1 م. و R. S. المساهمة بشكل متساو في هذا العمل. 2 إلى من يمكن معالجة المراسلات. إمايل: liorni mit. edu أور roy. bar-زيف weizmann. ac. il. مساهمات المؤلف: M. M. R. S. V. R. L. N. و R. H.B.-Z. تصميم البحوث M. M. و R. S. أجرى البحث V. R. ساهم أدوات جديدة رياجنتساناليتيك M. M. R. S. L. N. و R. H.B.-Z. تحليل البيانات و M. M. R. S. V. R. L. N. و R. H.B.-Z. . الكتاب تعلن أي تضارب في المصالح. هذا المقال عبارة عن جيناس ديريكت سوبيسيون. إن الجين المانع للورم p53 هو الهدف الأكثر شيوعا للتغيرات الوراثية في سرطان الإنسان (هولستين وآخرون 1997). يمكن للپروتين p53 النوع الوراثي أن يمارس مجموعة متنوعة من التأثيرات المضادة التكاثري، بما في ذلك تحريض دورة الخلايا الخلوية وموت الخلايا المبرمج (ليفين، 1997 هانسن أند أورين، 1997). وتظهر هذه التأثيرات عادة في الخلايا المعرضة لتلف الحمض النووي وأنواع أخرى من الإجهاد، مما يؤثر على بروتين p53 الكامن بخلاف ذلك ويسبب تراكمه وتنشيطه الكيميائي الحيوي (ليفين، 1997 هانسن أند أورين، 1997). تعتمد الفعالية العلاجية لعوامل مكافحة السرطان بشدة على قدرتها على تحفيز الخلايا المبرمجه في الخلايا السرطانية المستهدفة (فيشر، 1994). العديد من العوامل الفيزيائية والكيميائية الضارة دنا المستخدمة بشكل روتيني في علاج السرطان هي نشطة p53 المنشطات (كاستان وآخرون 1991 فريتش وآخرون 1993 زان وآخرون 1993). ونظرا للمساهمة الموثقة ل p53 في موت الخلايا المبرمج بالإشعاع (كلارك وآخرون 1993 لو وآخرون 1993)، كان من الممكن تصور أن الخلايا التي تحتفظ بالوزن الوظيفي p53 ستكون أكثر عرضة للقتل من قبل العديد من العوامل المضادة للسرطان. وقدمت العديد من الدراسات الأساسية والسريرية اللاحقة المزيد من الدعم لهذه الفكرة (لو، 1995). في الأورام البشرية، فإن غالبية التعديلات الجين p53 هي طفرات مغلطة، في كثير من الأحيان داخل مجال الحمض النووي الملزم الحفاظ على المجال الأساسي للبروتين (ليفين، 1997 هانسن وأورين 1997). قد تكون ميزة انتقائية الأولية من هذه الطفرات جيدا القضاء على النشاط الخلوي p53 بالوزن. ومع ذلك، على النقيض من الملاحظات على العديد من الجينات الأخرى الكابتة للورم، الخلايا مع الطفرات p53 عادة الحفاظ على التعبير عن طول كامل طول الطافرة البروتين، في كثير من الأحيان على مستويات مرتفعة بشكل ملحوظ. هذا يشير إلى أن بعض أشكال متحولة على الأقل من p53 قد تمتلك مكاسب من وظيفة، حيث أنها تسهم بشكل إيجابي في تطور السرطان (ميشالوفيتز وآخرون، 1991). وبما أن المسوخ p53 يمكن أن يمارس أيضا تأثيرات سلبية سلبية على p53 المعبر عنه، لا يمكن الحصول على أدلة رسمية لكسب الدالة إلا بإدخال p53 متحولة في خلايا تفتقر إلى p53 تماما (ميشالوفيتز وآخرون 1991). وقد تم تقديم هذه الأدلة من خلال مزيج من المختبر (ديتمر وآخرون 1993) وفي الجسم الحي (ديتمر وآخرون 1993 وولف وآخرون 1984 هسياو وآخرون 1994) الدراسات، حيث البروتينات p53 متحولة منحت خصائص تحول في الثقافة و زيادة الأورام في الفئران. وقد بذلت محاولات واسعة لربط حالة p53 مع التكهن والاستجابة العلاج من مرضى السرطان. وقد وجد أن وجود الطفرات p53 يتنبأ بتنبؤ أسوأ وتقلل من الاستجابة للعلاج في الكثير (لوي، 1995 الروبي وآخرون 1993 واتل وآخرون 1994 روش وآخرون 1995 ريغيتي وآخرون 1996 تراوبيرت وآخرون 1996 حمادة إت وآخرون 1996 غوه وآخرون 1995)، وإن لم يكن كل (ماكريس وآخرون 1995 ماثيو وآخرون 1995 كوت وآخرون 1997)، والأورام. فقدان النشاط بالوزن p53 يمكن أن يحسب بشكل كامل للزيادة الراديوية والكيميائية للأورام التي تحمل الطفرات p53. ومع ذلك، إذا قبل المرء وجود مكاسب من الطفرات p53 وظيفة، قد يكون السبب في أن بعض من زيادة مقاومة واضحة للعلاج قد يكون راجعا إلى الآثار الواقية المباشرة للبروتينات p53 متحولة. في الواقع، فإن سلوك خلايا الماوس اللوكيميا معربا عن درجة حرارة متحولة p53 متحولة يتسق مع هذا المفهوم (اللوط و ساشس 1995 بيليد وآخرون 1996). لذلك قدمنا ​​العديد من المسوخ p53 الإنسان المستمدة من الورم في خلايا P53 نول H1299 الرئة غدية. وكشفت المقايسات البقاء على قيد الحياة كلونوجينيك أن الخلايا أوفيركسريسينغ البروتينات p53 متحولة أصبحت أكثر صرامة للآثار السامة للخلايا من الأدوية العلاج الكيميائي. هذا يبدو بسبب، على الأقل جزئيا، إلى قدرة البروتينات p53 متحولة لإعطاء مقاومة متزايدة ضد المخدرات التي يسببها موت الخلايا المبرمج. الأهم من ذلك، كان تأثير وقائي متحولة والمخدرات محددة. وهكذا، p53His175 و p53His179 قدمت مقاومة كبيرة ل إتوبوسيد، في حين أن تأثير وقائي من p53His273 و p53Trp248 كان أكثر اعتدالا بكثير. من ناحية أخرى، p53His175 و p53His273 تمارس آثارا متطابقة عمليا على الاستجابة ل سيسبلاتين كل من المسوخ عززت بشكل ملحوظ البقاء على قيد الحياة المستنسخة ومثبطات موت الخلايا المبرمج عندما تم علاج الخلايا مع تركيزات منخفضة المخدرات، ولكن ليس له أي تأثير في وجود تركيزات عالية. وعموما، تشير هذه النتائج إلى أن أوفيركسريسيون من بعض الأشكال على الأقل p53 متحولة قد تعزز مباشرة مقاومة الخلايا السرطانية لعوامل مكافحة السرطان، بطريقة تعتمد على كل من طفرة معينة وهوية الدواء. هذا المكسب الانتقائي للوظيفة قد يسهم في فشل العلاج الكيميائي. توليد H1299 السكان الخلية معربا عن المسوخ p53 لدراسة متحولة p53 كسب وظيفة، تم نقل ترانسفكتد المسوخ p53 المستمدة الورم مختلفة في p53 خالية الرئة الإنسان سرطان الغدة H1299 خط الخلية (ميتسودومي وآخرون 1992). واستخدمت استراتيجيتان لتفادي الاختلافات النسوية غير المرغوبة. في أحد النهج تم ترانزفكتد الخلايا بشكل ثابت وعشرات من المستعمرات تم حصادها معا والحفاظ عليها بعد ذلك كمجمع مختلط. لكل مسكن p53، تم إنشاء تجمعين مستقلين وتحليلها بالتوازي. في نهج بديل، تم تحليل الثقافات ترانزفكتد عابر مباشرة. جميع حمامات ترانزفكتد بثبات أوفيركسرسد مستويات مماثلة للبروتينات p53 متحولة المقابلة، في حين أن الخلايا H1299 ترانزفكتد مع ناقلات وحدها كانت سلبية ل p53 (الشكل 1A). كشفت إمونوستينينغ (الشكل 1B) توطين النووي السائد لجميع المسوخ. وتجدر الإشارة إلى أن بعض الخلايا الموجودة في كل تجمع كانت إيجابية فقط ل p53، مما يشير إلى أن بقية الخلايا تحمل مقاومة للأدوية فقط. كان الجزء الموجب p53 حوالي 30 45 40، على النحو الذي يحدده تلطيخ ل p53 تليها تحليل فاكس (لا تظهر البيانات). إتوبوسيد يعزز إثراء انتقائية من p53His175-أوفيركسريسينغ الخلايا إذا p53 متحولة يمكن أن توفر زيادة المقاومة الكيميائية، يمكن للمرء أن يتوقع أن العلاج من السكان المختلطة مع الأدوية السامة للخلايا المناسبة سوف تثري انتقائيا للخلايا السرطانية أوفيركسريسينغ هذا البروتين متحولة. لاختبار هذا المفهوم، استغلنا حقيقة أن فقط حوالي ثلث الخلايا في كل تجمع ترانزفكتد بثبات في الواقع p53 أوفيركسريسد. وقد تعرضت مجموعات من خلايا H1299، ترانزفكتد إما p53His175 أو p53His273، لفحص مقايسة البقاء على قيد الحياة مع أو بدون إضافة إتوبوسيد المخدرات المضادة للسرطان، وهو مثبط توبويزوميراز الثاني. استغرق العلاج مع إتوبوسيد (10 M التركيز النهائي) 48 ساعة. ثم تم غسل الدواء بعيدا وسمحت الثقافات لاستعادة لمدة 14 يوما أخرى، مما أدى إلى تزايد المستعمرات. في نهاية هذه الفترة، تم إصلاح الثقافات والمستعمرات الفردية وسجل بواسطة المناعية للتعبير p53 متحولة. وقد لوحظت ثلاثة أنواع من المستعمرات: تلك التي 90 أو أكثر من الخلايا الملون بقوة (المشار إليها في الشكل 2A انظر أيضا الشكل 5B)، تلك التي كانت جميع الخلايا السلبية ل p53 (المشار إليها -)، ونوع وسيطة حيث فقط كانت أقلية من الخلايا ملطخة بقوة، وعادة في وسط المستعمرة، مما يشير إلى فقدان التعبير p53 خلال نمو مستعمرة (-). عندما كانت P53His273 ترانسفكتانتس (الشكل 2A H-273) مطلية بكثافة منخفضة دون اختيار إتوبوسيد، عرضت حوالي 30 من المستعمرات الناشئة أوفيركسريسيون p53 متحولة واسعة (أشرطة فارغة)، في حين أن أكثر من نصف المستعمرات كانت عمليا p53 سلبية (فارغة الحانات، -). وهذا يتوافق بشكل وثيق مع النسبة المئوية للخلايا إيجابية p53 داخل التجمع في بداية التجربة، مشيرا إلى أن وجود p53 متحولة ليس له تأثير على كفاءة الاستنساخ في ظل ظروف غير مؤكدة. وأسفر علاج الإتوبوسيد عن انخفاض كبير في الكفاءة الكلية لتكوين المستعمرات (لم تظهر البيانات)، مما يشير إلى أن غالبية الخلايا في البركة المعالجة قد تضررت بعد الانتعاش. ومع ذلك، من بين المستعمرات التي ظهرت في نهاية المطاف، ونمط من p53 أوفيركسريسيون متحولة كان عمليا مطابقا للثقافة غير المعالجة (الشكل 2A القضبان شغلها). وبالتالي، أوفيركسريسيون من p53His273 لا يبدو أن توفر إتوبوسيد المعالجة H1299 الخلايا مع أي بقاء انتقائية أو ميزة النمو. تحليل الخلايا p53His175-ترانزفكتد (H-175، الشكل 2A) كشفت صورة مختلفة جدا. كما هو الحال في تجمع H-273، سوى أقلية من المستعمرات التي نشأت في الثقافات غير المعالجة تحتوي على الأقل على بعض الخلايا p53-أوفيركسريسينغ متحولة (أشرطة فارغة، و-). وكانت نسبة هذه المستعمرات (أعلى بقليل من 30) مماثلة جدا لتلك التي من الخلايا p53-أوفيركسريسينغ الفردية داخل تجمع مختلط الأولي. ومع ذلك، عندما تم معالجة الخلايا H-175 مطلي أولا مع إتوبوسيد ثم سمح لاسترداد، فإن نسبة المستعمرات الناتجة بدرجات مختلفة من p53 أوفيركسريسيون الآن أصبح أعلى بكثير، ليصل إلى ما مجموعه حوالي 75 (الحانات شغلها، و-). وبالتالي، المستعمرات أوفيركسريسينغ p53His175 ولكن ليس p53His273 المخصب بشكل انتقائي في الثقافات المعالجة إتوبوسيد. إغناء لمستعمرات p53His175 يمكن أن يكون راجعا إلى معدل نمو جوهري أسرع من هذه المستعمرات، بدلا من زيادة المقاومة الكيميائية. لاستبعاد هذه الإمكانية، تم إجراء مقايسة تكوين مستعمرة مقارنة على الثقافات غير المعالجة. كما رأينا في الشكل 2B. لم يكن هناك فرق في عدد المستعمرة أو متوسط ​​حجم المستعمرة بين H-175 والسيطرة H - الجدد حمامات. مجتمعة، هذه النتائج تعني أن أوفيركسريسيون من p53His175، ولكن ليس p53His273، يوفر ميزة البقاء على قيد الحياة انتقائية المستنسخة لخلايا H1299 تتعرض للعمل السامة للخلايا من إتوبوسيد. P53 متحولة يعطي مقاومة انتقائية لتأثير أبوبتوتيك من إتوبوسيد يمكن تفسير ممكن للنتائج المذكورة أعلاه أن p53His175 يعطي تأثير وقائي ضد إتوبوسيد الناجم عن موت الخلايا المبرمج. لاستكشاف هذه الإمكانية، تم معاملة خلايا كل تجمع ترانزفكتد مع إتوبوسيد وفرزها في فاكس وفقا لمحتوى p53 بهم. وتحقيقا لهذه الغاية، كانت الخلايا الملطخة لأول مرة مع الأجسام المضادة p53 محددة. بعد ذلك، وباستخدام إجراء تبييض قياسي (هوبت وآخرون 1995 انظر أيضا الشكل 4)، تم حل كل السكان في عالية (H) وانخفاض (L) p53 إكسبريسورس، وهذا الأخير ربما المقابلة للخلايا تلطيخ سلبية ل p53 في الشكل 1B. كما هو متوقع، لم يتم الكشف عن المعجبين عالية في تجمع ترانزفكتد مع ناقلات فقط (H-نيو). ثم تم تحليل كل من المجموعات الفرعية العالية والمنخفضة ضمن مجموعة معينة بشكل منفصل لوجود خلايا ذات محتوى دنا دون G1، مما يدل على موت الخلايا المبرمج (هوبت وآخرون 1995 دارزينكيويتز، 1995). هذا البروتوكول، الذي يستفيد من الطبيعة المختلطة لكل تجمع، يسمح المقارنة المباشرة بين الخلايا التي تعبر P53 متحولة وفيرة وتلك التي تعبر عن القليل جدا أو لا شيء على الإطلاق، والحفاظ على جميع داخل نفس الثقافة وتحت ظروف تجريبية متطابقة تماما. وبالتالي، فإن التحليل لا يتأثر بالتقلبات التجربة إلى التجربة في حركية ومدى موت الخلايا المبرمج. وتظهر نتائج هذا التحليل فاكس في الشكل 3A. في الثقافات غير المعالجة، كان توزيع دورة الخلية متطابقا عمليا بين المعبرين P53 العالية والمنخفضة (لم تظهر البيانات)، وكان لا يمكن تمييزه عن خلايا H1299 الأبوية. التعرض ل 10 M إتوبوسيد الناجم عن موت الخلايا المبرمج واسعة في ناقلات H1299 ناقلات-ترانزفكتد (H-نيو) أكثر من 40 من الخلايا عرض محتوى الحمض النووي دون مضاعف بعد 48 ساعة من العلاج. وبالإضافة إلى ذلك، لوحظ تراكم بارز من الخلايا في G2. تم الكشف عن صورة مشابهة جدا من قبل المجموعات الفرعية الفرعية منخفضة من كل من p53His175 و p53His273 حمامات ترانزفكتد (H-175، L و H-273، L، على التوالي). على النقيض من ذلك، لوحظ انخفاض كبير في موت الخلايا المبرمج في إرتفاع المستعرض العالي (H) من تجمع H-175. لافت للنظر، في حين أن الخلايا أوفيركسريسينغ p53His273 يبدو أيضا للحفاظ على موت الخلايا المبرمج الموهن، وكان هذا تأثير وقائي واضح أكثر اعتدالا بكثير من مع p53His175. p53His179 أيضا منح حماية كبيرة ضد إتوبوسيد الناجم عن موت الخلايا المبرمج عندما أوفيركسرسد في خلايا H1299، على الرغم من أن تأثيره كان أقل وضوحا إلى حد ما من أن p53H175 (الشكل 3A). من ناحية أخرى كان p53Trp248 غير فعالة نسبيا، على غرار p53His273. ويظهر الشكل 3 ب تجميع البيانات من تجارب متعددة، توظف اثنين من حمامات مستقلة من كل متحولة. تم الحصول على صورة مماثلة لخلايا H1299 ترانزفكتد عابر مع p53His175 البلازميد ترميز، عندما تم تحليل الثقافة للتعبير p53 وبعد ذلك لمحتوى الحمض النووي (الشكل 4). كما كان متوقعا ل ترنسفكأيشن عابرة، كان هناك عدد أقل من المنتجين p53 عالية حتى الآن، كانت هذه الخلايا صهر بشكل كبير لقتل من قبل إتوبوسيد، على غرار نظرائهم ترانزفكتد بثبات. مجتمعة، كل النتائج المذكورة أعلاه تشير إلى أن p53His175، وإلى حد أقل إلى حد ما أيضا p53His179، يمنح الخلايا H1299 حماية كبيرة ضد السمية الخلوية إيتوبوسيد. P53 متحولة يعطي مقاومة لتركيزات منخفضة ولكن ليست عالية من سيسبلاتين نحن التالي يرغب في معرفة ما إذا كانت المسوخ p53 مختلفة يمكن أن تؤثر أيضا على الاستجابة الخلوية لدواء آخر مضاد للسرطان، الذي آلية بيوكيميائية عمل يختلف كثيرا عن إتوبوسيد. تحقيقا لهذه الغاية، أجرينا فحص البقاء على قيد الحياة كلونوجينيك على حمامات H1299 ترانزفكتد بثبات بعد العلاج لمدة 72 ساعة مع سيسبلاتين (رابطة الدول المستقلة-دب). كما رأينا في الشكل 5A. تركت P53 متحولة في الواقع قادرة على منح حماية جزئية أيضا ضد رابطة الدول المستقلة-دب، عند تطبيقها في تركيز منخفض نسبيا من 2.5 غم وقد انعكس هذا من خلال إثراء المستعمرات إيجابية p53 إلى حوالي 60 45 70 من المجموع، مقارنة إلى حوالي 30 45 35 في الخلايا غير المعالجة. ويبين الشكل 5 ب أمثلة تمثيلية من ثلاث فئات مختلفة من المستعمرات التي تم الحصول عليها في هذه التجربة. ومع ذلك، خلافا للآثار مختلفة جدا من p53His175 و p53His273 على المقاومة إتوبوسيد، في حالة من سيس-دب نوعين من المسوخ p53 عرضت قدرات وقائية مشابهة جدا وقد تم إثراء الخلايا أوفيركسريسينغ p53His273 بكفاءة مثل تلك أوفيركسريسينغ p53His175. وكان هذا يرتبط ارتباطا وثيقا مع قدرة مماثلة من المسوخ على حد سواء لحماية H1299 ضد تحريض موت الخلايا المبرمج من خلال هذا التركيز من رابطة الدول المستقلة-دب، عند تحليلها في نهاية فترة العلاج 72 ساعة (الشكل 6A). وكشفت صورة مختلفة بشكل ملحوظ عندما تعرضت الخلايا إلى 10 غم من رابطة الدول المستقلة-دب. هذا التركيز العالي ألغى تماما قدرة H1299 أن تؤدي إلى نمو المستعمرات، بغض النظر عما إذا كانوا أو لم يعبروا أي p53 متحولة وبالتالي، لم يتم الحصول على أي مستعمرات على الإطلاق في فحص البقاء على قيد الحياة المستنسخة (الشكل 5 أ لوحات الحق). وظل هذا دون تغيير حتى بعد فترة أطول من الانتعاش لمدة تصل إلى 30 يوما بعد العلاج سيس-دب (لا تظهر البيانات)، مما يعني أن تأثير سيس-دب لا رجعة فيه. كشف تحليل موت الخلايا المبرمج بعد 48 ساعة من التعرض ل 10 غم رابطة الدول المستقلة-دب أن أيا من المسوخ اثنين كان له أي تأثير وقائي، على عكس الوضع ينظر مع 2.5 غم من المخدرات. هذا يتسق مع عدم قدرة هذه المسوخ لتقديم ميزة كشفها في مقايسة البقاء على قيد الحياة كلونوجينيك (الشكل 5A). والمثير للدهشة، أن الجزء الكلي من الخلايا مع محتوى الحمض النووي الفرعي G1 كان في الواقع أقل من 2.5 غم، وكان ينظر إلى صورة مماثلة أيضا عندما تم فحص الثقافات تعامل سيس-دب بعد علاجات أطول أو أقصر مع 10 غم رابطة الدول المستقلة-دب (البيانات غير ظاهر). وهذا يشير إلى أن H1299 الاستجابة لهذا التركيز عالية سيس-دب بطريقة مختلفة جدا من العلاجات المخدرات الأخرى درس هنا. وهذا يمكن أن ينطوي إما على نوع غير نمطي من الموت، مع انخفاض تجزئة الحمض النووي وفقدان الحمض النووي، وإلا فشل في تفعيل استجابة الوفاة المناسبة بسبب شلل الخلايا لا رجعة فيه عامة. في كلتا الحالتين، لا يتم تغيير هذه الاستجابة غير عادية من قبل p53 أوفيركسرسد متحولة. نحن تصف هنا وظيفة جديدة من البروتينات p53 متحولة أوفيركسرسد في كثير من الأحيان في سرطان الإنسان. ويتجلى هذا في زيادة مقاومة إتوبوسيد و سيسبلاتين (سيس-دب)، وهما وكلاء تستخدم عادة لعلاج السرطان. وقد وصفت صورة مماثلة مؤخرا لخلايا M1 اللوكيميا الفئران، حيث أوفيركسريسيون من الماوس p53vall35 متحولة تسبب زيادة مقاومة موت الخلايا المبرمج الناجم عن سيسبلاتين، دوكسوروبيسين أو - irradiation (لي وآخرون 1998). ومن الممكن تصور أنه ليس كل أنواع الخلايا قد تتصرف بشكل مماثل ل H1299، كما يقترح ذلك أن بعض الأورام وخطوط الخلايا تفشل في إظهار اقتران إيجابي بين الطفرات p53 وزيادة الكيمو و راديوريسيستانس (ماكريس وآخرون 1995 ماثيو وآخرون 1995 كوت وآخرون 1997 ريبيرو وآخرون 1997). وقد برهن على المكاسب البيولوجية لوظيفة p53 متحولة في عدد من النماذج التجريبية (مثل وولف وآخرون 1984 ديتمر وآخرون 1993 هسياو وآخرون 1994). وقد قدمت العديد من الدراسات الحديثة دعما إضافيا لهذا المفهوم الهام، فضلا عن رؤى جديدة للآليات الجزيئية الكامنة. وأفاد لاني وآخرون (1998) أن الجزء C - محطة من p53، بما في ذلك نطاق ملزم دنا ملزمة ونطاق أوليغوميريزاتيون، أمر ضروري لقدرة p53 متحولة لإعطاء الخلايا ترانزفكتد مع القدرة على حمل الأورام في الفئران. كان هناك حاجة أيضا إلى C - محطة، جنبا إلى جنب مع مجال N-ترانزاكتيفاتيون والنطاق الأساسي مسعور من p53، لتفعيل العديد من المروجين من قبل البروتينات p53 متحولة (لاني وآخرون 1998). وصف نشاط جديد مثير للاهتمام من p53 متحولة من قبل غوالبرتو وآخرون. (1998)، الذي وجد أن بعض البروتينات p53 متحولة يمكن أن تسهم مباشرة في عدم الاستقرار الجيني عن طريق إلغاء حاجز المغزل الانقسامية في الخلايا البشرية، مما يؤدي إلى تعدد الصبغيات واختلال الصيغة الصبغية في نهاية المطاف. تجدر الإشارة إلى أن المسوخ التوافقية فقط مثل p53His175 ولكن ليس المسوخ الاتصال الحمض النووي مثل p53Trp248 كانت قادرة على تعطيل حاجز المغزل (غوالبرتو وآخرون 1998). هذا يذكرنا بشكل ملحوظ من الآثار المختلفة لهذه المسوخ على المقاومة إتوبوسيد، كما هو موضح في تحليلنا. ولا يزال يتعين تحديد ما إذا كانت هناك علاقة آلية بين هذين النوعين من كسب الدالة. لا تزال الآلية الجزيئية الكامنة وراء هذا النشاط البيولوجي الجديد من p53 متحولة ليتم توضيحها. يمكن ل p53 متحور أن يعيد صياغة التعبير عن مجموعة متنوعة من الجينات (على سبيل المثال تشين وآخرون 1992 ديب وآخرون 1992 ديتمر وآخرون 1993 تسوتسومي-إيشي وآخرون 1995 لوديس-مايرز وآخرون 1996). وفي الآونة الأخيرة، تبين أن الجين الورمي الجيني كان هدفا قويا لكثير من البروتينات p53 المتحولة، وربما يمثل بعض آثارها الورمية (فريزير وآخرون، 1998). وبالتالي فمن الممكن أن p53 متحولة أيضا يغير التعبير عن الجينات المرتبطة بالسيطرة على موت الخلايا الناجم عن العلاج الكيميائي في خلايا H1299. يمكن لبعض المسوخ p53 تنشيط المروج من الجينات المقاومة المتعددة (MDR1) (تشين وآخرون 1992). هذا التنشيط قد يحسب من حيث المبدأ على تأثير واضح لمكافحة موت الخلايا المبرمج، عن طريق منع تراكم تركيزات المخدرات فعالة داخل الخلايا. ومع ذلك، العديد من الحقائق تجادل ضد هذا التفسير الآلي. أولا، لم نتمكن من الكشف عن زيادة في MDR1 مرنا في حمامات ترانزفكتد (لا تظهر البيانات). ثانيا، p53His175 أوفيركسريسيون لم يؤثر على قدرة إتوبوسيد لفرض اعتقال G2 (انظر الشكل 3A)، بحجة أن الدواء يجري تسليمها بكفاءة في الخلية. ثالثا، كل من p53His273 و p53Trp248، التي لا تحمي بكفاءة ضد إتوبوسيد، يدفع المروج MDR1 على الأقل بقوة كما p53His175 (ديتمر وآخرون 1993). أخيرا، المقاومة ل سيس-دب لا يمكن توفيرها من قبل بروتين سكري MDR1، ولكن مع ذلك تم منحها من قبل البروتينات p53 متحولة في تجاربنا. وبالتالي، إذا p53His175 يعمل من خلال التنظيم النسخي، والأهداف ذات الصلة من المرجح أن تكون الجينات الأخرى من MDR1. وهناك احتمال واضح هو أوبريغولاتيون من جينات مكافحة موت الخلايا المبرمج، أو قمع منها موت الخلايا المبرمج. في هذا الصدد، فإن دراسة سابقة لم تجد علاقات متبادلة بين الطفرات p53 والتعبير عن العديد من الجينات التنظيمية موت الخلايا المبرمج في خطوط الخلايا سرطان الرئة المقاومة للأدوية (ريف وآخرون 1996). وبالتالي يبقى من الممكن أن يتم بوساطة مكاسب مكافحة موت الخلايا المبرمج من خلال آلية بيوكيميائية مستقلة عن التنظيم النسخي الجينات محددة. أحد الاحتمالات الجذابة هو أن البروتين p53 متحولة يربط ويحجز بروتينات معينة اللازمة لموت الخلايا المبرمج الفعال. يمكن أن يكون المرشحون المحتملون زب و شد (وانغ وآخرون 1996)، أو البروتينات المفترضة التي تتفاعل مع مجال بوليبروالين من p53 (ووكر و ليفين 1996 ساكامورو وآخرون 1997). تم تقييم قدرة مختلف المسوخ p53 لتغيير الاعتماد على المصل من خلايا K562 اللوكيميا مؤخرا (كريمينيتسكايا وآخرون 1997). ومن المثير للاهتمام، وجد أن p53His175 فضلا عن العديد من المسوخ الأخرى، ولكن ليس p53His273 و p53Trp248، جعلت هذه الخلايا أقل اعتمادا على عوامل البقاء على قيد الحياة في الدم. تشابه مذهل بين السلوك التفاضلي لهذه المسوخ p53 في اثنين من نظم تجريبية مختلفة جدا يقوي فكرة أن المسوخ مثل p53His175 قد تمارس تأثير واسع لمكافحة موت الخلايا المبرمج على الخلايا السرطانية. وتظهر بياناتنا بوضوح أن المسوخ p53 مختلفة يمكن أن تختلف على نطاق واسع فيما يتعلق قوة كيميائية ضد وكلاء محددة. هذا السلوك التفاضلي يعتمد على الموقع الدقيق للطفرة، وهوية الدواء، وأيضا تركيز الدواء. في حالة إتوبوسيد، الطفرات مثل He175 و His179، التي تغير التشكل العام لل p53 (ميلنر 1995)، هي أقوى بكثير من Trp248 و His273 التي تعطل التفاعلات p53 الحمض النووي محددة دون تغيير التشكل البروتين الكلي. وعلى النقيض من ذلك، فإن كلا الصفين من المسوخ p53 قادران على تقديم مقاومة متزايدة لتركيزات منخفضة من سيس-دب. وتشير بياناتنا إلى أن الأورام التي تؤوي طفرات p53 معينة قد تكون أقل استجابة لعوامل معينة مضادة للسرطان. ومن الجدير بالملاحظة أن العلاقة غير العشوائية بين طفرات p53 محددة من ناحية وزيادة المقاومة الكيميائية وأسوأ التكهن من ناحية أخرى، قد وصفت لسرطان القولون والمستقيم (غوه وآخرون 1995)، وسرطان الثدي (بورسن وآخرون 1995 بيرغ وآخرون 1995 آس وآخرون 1996)، وسرطان المبيض (ريغيتي وآخرون 1996) والساركوما الأنسجة الرخوة (تراوبيرت وآخرون 1996). هناك تداخل جزئي فقط بين الطفرات التي تعرف بأنها أكثر حدة في تلك الدراسات، وفي الوقت الحاضر قد يكون هذا بسبب الاختلافات بين أنواع الورم المختلفة، فضلا عن استخدام العقاقير العلاج الكيميائي متميزة. في الختام، النتائج التي توصلنا إليها يعني أن وجود طفرات p53 معينة قد تجعل الورم أقل استجابة لنظم العلاج معينة. وينبغي أن تمتد هذه النتائج إلى خطوط الخلايا إضافية والبيانات السريرية واسعة تحتاج إلى جمع وتقييمها بعناية من أجل تأكيد في الجسم الحي أهمية النتائج. في نهاية المطاف، وهذا قد يوفر أدلة هامة نحو قرارات العلاج أفضل. المواد والأساليب خطوط الخلايا، البلازميدات و ترانزفكتيونس خط الخلية H1299 مشتق من سرطان الرئة خلية كبيرة الإنسان (ميتسودومي وآخرون 1992). تم الحفاظ على خلايا H1299 في وسط رمي، تكمل مع 10 مصل الجنين العجل (فس). تم وصف المسوخ p53 الإنسان المستخدمة ل ترانسفكتيونس من قبل هيندس وآخرون. 1990). كان التعبير عن جميع المسوخ تحت السيطرة النسخي من محسن سمف إنزانبروموتر. قبل ترنسفكأيشن، تم تغيير وسط الثقافة إلى دمم تستكمل مع 10 فس. تم إجراء ترانسفكتيونس بواسطة طريقة فوسفات الكالسيوم (هوبت وآخرون 1995). بعد ترنسفكأيشن، تم تغيير المتوسطة مرة أخرى إلى RPMI10 فس، واستنساخ مستقر ترانزفكتد تم اختيارها في وجود 0.4 ملجم G418 لمدة 1 أسبوع. تحليل لطخة غربية تم تحليل الخلايا مباشرة في العازلة عينة البروتين، وتحميلها على 12.5 سدز بولي أكريلاميد هلام ونقلها إلى غشاء النيتروسليلوز. وقد تم البحث في وصمة عار مع خليط من الأجسام المضادة وحيدة النسيلة p53 وحيدة النسيلة الإنسان PAB1801 و دو-1 وتصور مع المعونة من مجموعة إكل (أمرشام). تم إصلاح الخلايا التي تزرع على كوفرسليبس الزجاج مع الميثانول الباردة واحتضنت في -20176C لمدة 30 دقيقة. بعد ريهيدراتاتيون مع برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق، كانت ملطخة الخلايا لمدة 1 ساعة مع خليط من باب 1801 و دو-1. تم إجراء تلطيخ مع الأجسام المضادة الثانوية ومع دابي كما هو موضح من قبل (هوبت وآخرون 1995)، تليها التصور تحت المجهر مضان. فحص نمو المستعمرات تم تصنيف الخلايا بكثافة 2000 لكل طبق 60 ملم. بعد أسبوع واحد تم إصلاح المستعمرات في الميثانول في درجة حرارة الغرفة وملطخة حل جيمزا تليها غسل بالماء. مقايسة بقاء النخاع تم علاج الخلايا التي تزرع على كوفرسليبس الزجاج (5 180 10 5 خلايا لكل 100 ملم طبق يحتوي على تسعة كوفرسليبس الزجاج) مع 10 إتوبوسيد لمدة 48 ساعة أو مع 2.510 غرام سيس-دب لمدة 72 ساعة. ثم تم غسل الخلايا مرتين في برنامج تلفزيوني وتجديدها مع رمي 10 فس جديدة. بعد أسبوعين تم إصلاح كوفرسليبس الزجاج في الميثانول الباردة وملطخة كما هو موضح أعلاه. تم تصور المستعمرات وسجل تحت المجهر مضان. بالنسبة للضوابط غير المعالجة، كانت 1 180 10 4 خلايا مطلية بالمثل على كوفرسليبس الزجاج تم إصلاح المستعمرات والملطخة بعد أسبوع واحد. لتحليل فاكس، تم الجمع بين الخلايا الملتصقة والفصل. تم إصلاح الخلايا، تفاعلت مع خليط من PAb1801 و دو-1 (1.50) لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة وملطخة الأجسام المضادة الثانوية ومع يوديد بروبيديوم (25 غم سيغما) كما هو موضح من قبل (هوبت وآخرون 1995) . تم تحليل الخلايا في فارز خلية فاسورت (بيكتون ديكنسون). وقد تم وصف غيتينغ للتعبير عن P53 العالية والمنخفضة كما هو موضح سابقا (هوبت وآخرون 1995). نود أن نشكر T ونجر، K فوسدن و B فوجلستين ل p53 البلازميدات التعبير و D لين ل دو-1. وقد دعم هذا العمل جزئيا من خلال منح RO1 كا 40099 من نسي، ومؤسسة العلوم بين الولايات المتحدة الأمريكية والولايات المتحدة الأمريكية، ومركز ليو وجوليا فورشهيمير للعلم الوراثي الجزيئي. غب هو الزمالة السابقة إيرك. غب يخصص هذا العمل ل سم. آس T، بوريسن آل، جيسلر S، سميث سورنسن B، جونسن H، فارهوج جي، أكسلن لا و لونينغ بي. (1996). ناتشر ميد. 2، 811 45 814. مدلين بيرغ J، نوربيرغ T، سجوجرن S، ليندغرين A أند هولمبرغ L. (1995). ناتشر ميد. 1، 1029 45 1034. مدلين بورسن آل، أندرسن تي، إيفجورد جي، كورنيليس رس، ثورلاسيوس S، بورغ A، جوهانسون U، ثيليت C، شيرنيك S، هارتمان S إت آل. (1995). الجينات كروموسوم. السرطان 14، 71 45 75. مدلين تشين كف، أويدا K، البستان الأول و غوتسمان مم. (1992). سسينس 255، 459 45 462. مدلين كلارك أر، بوردي كا، هاريسون دج، موريس رغ، بيرد سيسي، هوبر مل و ويلي A. (1993). ناتشر 362، 849 45 852. مدلين كوت ريد، غروشن S، جونز با و سكينر دغ. (1997). ناتشر 385، 123 45 124. ديب S، جاكسون كت، سوبلر ما ومارتن دو. (1992). J. فيرول. 66، 6164 45 6170. مدلين ديتمر D، باتي S، زامبيتي G، تشو S، تريسكي K، مور M، فينلي C و ليفين آج. (1993). طبيعة جينيت. 4، 42 45 46. مدلين الروبي S، توماس A، كوستين D، روزنبرغ C، بوتيسيل M، سيلبر R و نيوكومب إو. (1993). الدم 82، 3452 45 3459. مدلين فريزر مو، هو X، وانغ J، غو Z، كليفلاند جل و زامبيتي غب. (1998). مول. زنزانة. بيول. 18، 3735 45 3743. مدلين فريتسش M، هيسلر C أند براندنر G. (1993). الجين الورمي 8، 307 45 318. مدلين غوالبرتو A، ألداب K، كوزاكيويتز K و تلستي تد. (1998). بروك. NATL. أكاد. الخيال العلمي. الولايات المتحدة الأمريكية 95، 5166 45 5171. المادة مدلين حمادة M، فوجيوارا T، هيزوتا A، غوتشي A، ناوموتو Y، تاكاكورا N، تاكاهاشي K، روث جا، تاناكا N أند أوريتا K. (1996). J. السرطان ريس. كلين. Oncol. 122، 360 45 365. مدلين هوبت Y، روان S، شوليان E، فوسدن خ أند أورين M. (1995). جينيس ديف. 9، 2170 45 2183. مدلين هيندز بو، فينلي كا، كوارتين رس، بيكر سج، فيرون إير، فوجلستين B و ليفين آج. (1990). خلية نمو النمو. 1، 571 45 580. مدلين هولستين M، سوسي T، توماس G، فون-بريفرن M و بارتشش H. (1997). النتائج الأخيرة السرطان ريس. 143, 369 45 389. MEDLINE Hsiao M, Low J, Dorn E, Ku D, Pattengale P, Yeargin J and Haas M. (1994). Am. J. Pathol. 145, 702 45 714. MEDLINE Kastan MB, Onyekwere O, Sidransky D, Vogelstein B and Craig RW. (1991). Cancer Res. 51, 6304 45 6311. MEDLINE Kremenetskaya OS, Logacheva NP, Baryshnikov AY, Chumakov PM and Kopnin BP. (1997). Oncol. احتياط 9, 155 45 166. MEDLINE Lanyi A, Deb D, Seymour RC, Ludes-Meyers JH, Subler MA and Deb S. (1998). Oncogene 16, 3169 45 3176. MEDLINE Li R, Sutphin DP, Schwartz D, Matas D, Almog N, Wolkowicz R, Goldfinger N, Pei H, Prokocimer M and Rotter V. (1998). Oncogene 16, 3269 45 3278. MEDLINE Lotem J and Sachs L. (1995). بروك. Natl. أكاد. الخيال العلمي. USA 92, 9672 45 9676. MEDLINE Lowe SW, Schmitt EM, Smith SW, Osborne BA and Jacks T. (1993). Nature 362, 847 45 849. MEDLINE Ludes-Meyers JH, Subler MA, Shivakumar CV, Munoz RM, Jiang P, Bigger JE, Brown DR, Deb SP and Deb S. (1996). مول. زنزانة. بيول. 16, 6009 45 6019. MEDLINE Makris A, Powles TJ, Dowsett M and Allred C. (1995). Lancet 345, 1181 45 1182. MEDLINE Mathieu C, Koscielny S, Le Bihan ML, Spielmann M and Arriagada R. (1995). Lancet 345, 1182. Michalovitz D, Halevy O and Oren M. (1991). J. Cell. Biochem. 45, 22 45 29. MEDLINE Mitsudomi T, Steinberg SM, Nau MM, Carbone D, DAmico D, Bodner S, Oie HK, Linnoila RI, Mulshine JL, Minna JD et al . (1995). Oncogene 7, 171 45 180. Peled A, Zipori D and Rotter V. (1996). Cancer Res. 56, 2148 45 2156. MEDLINE Reeve JG, Xiong J, Morgan J and Bleehen NM. (1996). Br. J. Cancer 73, 1193 45 1200. MEDLINE Ribiero JC, Barneston AR, Fisher RJ, Mameghan H and Russel PJ. (1997). كثافة العمليات. J. Radiat. بيول. 72, 11 45 20. MEDLINE Righetti SC, Della Torre G, Pilotti S, Menard S, Ottone F, Colnaghi MI, Pierotti MA, Lavarino C, Cornarotti M, Oriana S et al . (1996). Cancer Res. 56, 689 45 693. MEDLINE Rusch V, Klimstra D, Venkatraman E, Oliver J, Martini N, Gralla R, Kris M and Dmitrovsky E. (1995). Cancer Res. 55, 5038 45 5042. MEDLINE Sakamuro D, Sabbatini P, White E and Prendergast GC. (1997). Oncogene 15, 887 45 898. MEDLINE Traubert H, Meye A and Wurl P. (1996). Cancer Res. 56, 4134 45 4136. MEDLINE Tsutsumi-Ishi Y, Tadokoro A, Hanaoka F and Tsuchida N. (1995). زنزانة. نمو. Diff. 6, 1 45 8. MEDLINE Wang XW, Yeh H, Schaeffer L, Roy R, Moncollin V, Egly JM, Wang Z et al . (1996). Genes Dev. 10, 1219 45 1232. MEDLINE Wattel E, Preudhomme C, Hecquet B, Vanrumbeke M, Quesnel B, Dervite I, Morel P and Fenaux P. (1994). Blood 84, 3148 45 3157. MEDLINE Zhan QM, Carrier F and Fornace AJ. (1993). مول. زنزانة. بيول. 13, 4242 45 4250. MEDLINE Figure 1 Expression of mutant p53 proteins in stable H1299 transfectants. ( a ) Western blot analysis. Cell lysates were prepared from the indicated stably transfected pools, resolved by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, and subjected to Western blot analysis with a mixture of the human p53-specific monoclonal antibodies PAb1801 and DO-1, or with an anti - - tubulin antibody to control for equal loading. Positions and sizes (in kD) of protein molecular size markers are indicated on the right. ( b ) Subcellular localization. Visualization of transfected p53 was done by indirect immunofluorescence, employing a mixture of PAb1801 and DO-1. DAPI staining was done in parallel in order to visualize the nuclei of all cells in the same field, irrespective of p53 expression status. H-248, H-273, H-175, H-179 and H-neo denote pools of H1299 cells transfected stably with mutants p53Trp248, p53His273, p53His175, p53His179 or neo vector control, respectively Figure 2 Clonogenic survival and colony formation assays of pools overexepressing different p53 mutants, following treatment with etoposide. ( a ) Clonogenic survival assay of H-175 versus H-273 without or with etoposide treatment. Untreated cultures (empty bars) were plated at low density, and one week later were fixed, stained with a mixture of Pab1801 and DO-1 and scored microscopically for p53 expression. Cultures to be treated (filled bars) were plated at a higher cell density (see Materials and methods), incubated in the presence of 10 M etoposide for 48 h and then allowed to resume growth without etoposide for another 2 weeks, at which time they were processed for p53 analysis as above. Individual colonies could be grouped into three categories, based on their p53 staining pattern. The first group () included colonies consisting of 90 45 100 p53-positive cells, the second (--) consisted of only p53-negative cells, and the intermediate category (-) included colonies comprising a cluster of p53-positive cells surrounded by p53-negative ones. Each value represents the average of four separate experiments the standard error is indicated. The total numbers of colonies scored in each case were as follows: H-175 control, 936 colonies H-273 control, 1539 colonies H-175etoposide, 309 colonies H-273etoposide, 330 colonies. ( b ) Colony growth assay. Equal numbers of cells of the H-neo and H-175 pools were plated and stained as described in Materials and methods. Shown are three triplicate dishes of each pool Figure 4 Transient overexpression of mutant p53 confers increased resistance to cell killing by etoposide. A culture of H1299 cells was transfected transiently with p53His175 expression plasmid (5 g10 cm dish). Twenty-four hours later, etoposide was added to a concentration of 10 M for an additional 48 h. Cultures were analysed for p53 expression levels (left panel) p53 fluorescence is plotted forward scatter, serving as an approximation of cell size (forward scatter). The horizontal bar was set arbitrarily as the boundary between low (L) and high (H) p53 expressors the same cut-off was also used to define the H and L sub-populations throughout the experiments in Figure 3 a and b . Each of the indicated sub-populations was monitored separately for DNA content distribution (right panels) Figure 3 Stable overexpression of mutant p53 confers increased resistance to cell killing by etoposide. Each of the indicated stably transfected H1299 cell pools was either exposed to 10 M etoposide for 48 h or left untreated, and then subjected to flow cytometric DNA content analysis (see Materials and methods). Briefly, fixed cells were stained with propidium iodide (PI) and with p53-specific antibodies. Each population was first resolved into high (H) and low (L) p53 expressors, and then each of these two sub-populations was analysed separately for DNA content (PI staining). ( a ) DNA content profiles. Pool denominations are as in Figure 1a. Indicated below are the positions of cells with G1 and G2M DNA content, as well as of cells with sub-G1 DNA content, taken to be apoptotic. Percentages of cells with sub-G1 DNA content are indicated above the corresponding horizontal bars. For untreated cultures, only the low expressor fraction is shown the high expressor fractions exhibited practically identical cell cycle distributions, including a similar very low rate of background apoptosis (data not shown). ( b ) Compilation of data from several experiments of the type shown in a . Filled and empty bars denote the low and high p53 expressor sub-populations, respectively. Each bar represents the average of at least three separate experiments in most cases, data was acquired from two independent pools of H1299 cells transfected with the same p53 mutant. The standard error is indicated Figure 5 Clonogenic survival assay of H-175 versus H-273 without or with cisplatin treatment. Experimental details were exactly as in Figure 2, except that the indicated stably transfected H1299 pools were treated for 72 h with either 2.5 gml or 10 gml cisplatin (cis-DDP), and then the drug was removed and the cells were allowed to form colonies for another 14 days. ( a ) Clonogenic survival data see legend of Figure 2a for further details. The total numbers of colonies scored in each case were as follows: H-175 control, 872 colonies H-273 control, 1070 colonies H-1752.5 gml cis-DDP, 360 colonies H-2732.5 gml cis-DDP, 560 colonies. ( b ) The three types of colonies obtained in the clonogenic survival assay. Each panel depicts a segment of one representative colony, containing either only mutant p53-overexpressing cells (), or a mixture of p53-positive and negative cells (-), or only p53-negative cells (--). Further details as in Figure 1b Figure 6 Stable overexpression of mutant p53 confers increased resistance to cell killing by low but not high concentrations of cisplatin. The indicated stably transfected H1299 cell pools were treated with either 2.5 gml ( a ) or 10 gml ( b ) of cisplatin (cis-DDP). Cell cycle profiles were determined after 72 h of treatment, as detailed in Figure 3a. Only the treated cells are shown for untreated cell profiles, see Figure 3a